1．定義
羅丹明B是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料，英文名：Rhodamine B；分子式C28H31ClN2O3；分子量479.0175；結(jié)構(gòu)式為：
羅丹明B在溶液中有強(qiáng)烈的熒光, 用作實驗室中細(xì)胞熒光染色劑、有色玻璃等行業(yè)。不容許用作食品染色。
2．檢測原理
羅丹明B具有脂溶性，被用作調(diào)味品（主要是辣椒粉和辣椒油）染色劑。使用了被污染的調(diào)味品制作食品時會造成殘留。調(diào)味品使用羅丹明B染色時含量較高，甚至直接摻入，可進(jìn)行現(xiàn)場檢測。食品中因其含量較低，需送實驗室檢測。現(xiàn)場檢測中使用非極性有機(jī)溶劑（例正己烷、正己烷+丙酮等）將其溶解并提取出，提取液流過中性氧化鋁固相萃取小柱吸附羅丹明B，用非極性有機(jī)溶劑（例正己烷）淋洗小柱，洗脫樣品油脂和食品內(nèi)源性干擾物，用肉眼可觀測到在小柱上出現(xiàn)鮮亮的粉紅色條帶，判定為可疑樣品，該樣品需送實驗室作進(jìn)一步確證檢驗。實驗室檢測法仍然采用非極性有機(jī)溶劑（例正己烷、正己烷+丙酮等）將羅丹明B 從食品中溶解并提取出，提取液流過中性氧化鋁固相萃取小柱吸附羅丹明B，用非極性有機(jī)溶劑（例正己烷）洗脫樣品油脂和食品內(nèi)源性干擾物，再用極性有機(jī)溶劑（例甲醇）將羅丹明B從小柱上洗脫并收集，用反相液相色譜儀-紫外/可見光檢測器進(jìn)行定性定量檢測。
3．試劑和材料
3.1 層析用中性氧化鋁（100目），用前于105℃烘2小時，取下置干燥器中冷至室溫，裝入玻璃瓶中密閉放置。
3.2 正己烷（分析純）；
丙酮（分析純）；
甲醇（色譜純）；
3.3 20%丙酮的正己烷液：取100ml丙酮加400ml正己烷混合，作為羅丹明B的提取液和凈化液。
3.4 氧化鋁固相萃取小柱：取5 ml塑料注射器管，下端口塞入小塊脫脂棉，裝入處理好的氧化鋁約3cm高，放置備用。
3.5 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取羅丹明B （分析純試劑 沈陽試劑三廠）5.0mg，用20%丙酮的正己烷液（3.3）溶解并定容至50ml，配成含量為100ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取此液0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0ml，用20%丙酮的正己烷液（3.3）稀釋并定容至50ml，配成濃度為 0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ug/ml標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。
3.6 玻璃器具
4．現(xiàn)場快速檢測方法
4.1 辣椒粉 取辣椒粉一小勺（約5g）放入小燒杯中，加入約40ml含20%丙酮的正己烷（3.3），搖動或攪拌2分鐘，靜置。取5 ml塑料注射器套管，下端口塞入小塊脫脂棉，將事先處理好的氧化鋁（3.1項）倒入注射器管中約3cm高，做成氧化鋁固相萃取小柱，待樣品杯上方澄清后，慢慢倒入小柱中，下端接一廢液杯，視顏色深淺倒入2-5ml，注意不要倒入太多，保證小柱的中下部仍為白色， 此時，含羅丹明B的樣品在柱上部會出現(xiàn)鮮亮的粉紅色的熒光條帶，條帶邊緣清晰，粉紅色隨含量的增加而加深和加寬，不含羅丹明B的樣品提取液不會出現(xiàn)粉紅色條帶，只會出現(xiàn)黃紅色的界面不清晰的寬帶，然后用含20%丙酮的正己烷（3.3）20ml慢慢倒入小柱，粉紅色的條帶不下移，但更清晰，其余的黃紅色帶下移，可大部分被洗脫出，即可判斷為含羅丹明B的可疑樣品。
4.2 辣椒油 取辣椒油一小勺（約2g）放入小燒杯中，加入約10ml正己烷（3.2），混勻。按4.1項中“取5 ml塑料注射器套管，……即可判斷為含羅丹明B的可疑樣品。”操作。
4.3 判定 初步判斷為含羅丹明B的可疑樣品需送實驗室中進(jìn)行液相色譜確證檢驗。
5．實驗室檢測方法
5.1．儀器
液相色譜儀 （雙泵、紫外/可見光檢測器）
色譜柱 C18 4.6mm X 15cm（5μm）
5.2．提取和純化
5.2.1 辣椒粉：取辣椒粉1g，加入20ml含20%丙酮的正己烷（3.3），震搖10分鐘，靜置或過濾使分離出上層清液，殘渣加入10ml含20%丙酮的正己烷（3.3）重復(fù)提取一次，合并2次提取液，混勻，用滴管將上清液加入氧化鋁小柱（3.4）中[小柱預(yù)先用5ml提取液（3.3）潤濕]，視顏色深淺決定上柱量，保證上完樣的小柱中下部仍為白色，含羅丹明B的樣品提取液在柱上部會出現(xiàn)鮮亮的粉紅色的熒光條帶，且粉紅條帶隨含量的增加而加深和加寬，不含羅丹明B的樣品提取液不會出現(xiàn)粉紅色條帶，只會出現(xiàn)黃紅色的不清晰的寬帶，用含20%丙酮的正己烷（3.3）洗小柱，粉紅色的條帶不下移，但更清晰，其余的黃紅色帶下移可大部分被洗脫出，可判斷為含羅丹明B的可疑樣品，待洗柱的流出液無色時，滴入5-10ml甲醇，將羅丹明B色帶洗下并收集，用甲醇定容后，注入液相色譜儀進(jìn)行確認(rèn)。
5.2.2．辣椒油：稱取辣椒油1g，加入10ml含20%丙酮的正己烷（3.3），混合均勻后滴入氧化鋁小柱（3.4）中，按照5.2.1項中“用滴管將上清液加入氧化鋁小柱……注入液相色譜儀進(jìn)行確認(rèn)”進(jìn)行操作。
5.2.3.其它食品：對于使用了紅辣椒油（粉）調(diào)味的食品（如紅油豆制品、紅油魚干等）稱取10-20g，用20%丙酮的正己烷（3.3）洗下紅油（粉），或?qū)悠放c洗脫液攪成勻漿將羅丹明B溶解提取出，將樣品液靜置或離心，分出有機(jī)相，根據(jù)水分的多少加入適量脫水，按照5.2.1項中“用滴管將上清液加入氧化鋁小柱……注入液相色譜儀進(jìn)行確認(rèn)”進(jìn)行操作。含量少的樣品因粉紅色條帶太窄和顏色較淡肉眼看不清楚，仍可采用上述辦法，進(jìn)一步用20%丙酮的正己烷（3.3）洗滌小柱至流出液無色時，滴入5-10ml甲醇，將羅丹明B色帶洗下并收集，經(jīng)濃縮后，注入液相色譜儀進(jìn)行確證檢驗。
5.3 液相色譜條件
5.3.1 色譜柱：C18 4.6mm X 15cm（5μm） 進(jìn)樣 5ul
5.3.2 流動相：75%甲醇水溶液 1ml/min
5.3.3 檢測器: 紫外/可見光（UV/VIS）檢測器；波長：550nm
5.3.4 定性定量：羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間定性，外標(biāo)法定量。
5.4 結(jié)果計算
Y = C×V/M
Y——樣品中羅丹明B的含量（mg/kg）
C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的羅丹明B的濃度（ug/ml）
V——測試樣品總定容體積（ml）
M——樣品的稱樣量（g）
5.5 注意事項：①使用C18柱的性能有差異，流動相濃度應(yīng)略作調(diào)整。②在本法所給分離條件下，樣品基質(zhì)在羅丹明B附近無干擾峰，其他許多紅色偶氮染料均可在羅丹明B之后出峰，注意調(diào)整這些干擾峰與羅丹明B分離度，干擾的成分為：蘇丹橙G、對位紅、7B、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。（色譜儀器網(wǎng)）
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