細(xì)胞毒性是由合成化合物、細(xì)胞自然產(chǎn)生毒性或免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞(如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,自然殺傷細(xì)胞等)引起的細(xì)胞殺傷事件。目前主要通過(guò)對(duì)受損細(xì)胞釋放的相關(guān)底物(如乳酸脫氫酶-LDH)進(jìn)行定量,從而判斷細(xì).胞膜的受損情況。本期，將為大家講解有關(guān)細(xì)胞毒性的檢測(cè)產(chǎn)品、原理及特點(diǎn)等內(nèi)容。

ldh細(xì)胞毒性檢測(cè) (乳酸脫氫酶）是穩(wěn)定的胞漿酶，存在所有的細(xì)胞中，當(dāng)胞膜損傷時(shí)快速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中。LDH活性通過(guò)兩個(gè)酶催化反應(yīng)：LDH氧化乳酸鹽生成丙酮酸鹽，然后丙酮酸鹽和四唑鹽INT反應(yīng)生成甲（formazan）結(jié)晶。甲（formazan）結(jié)晶量在培養(yǎng)液中的增加，與裂解的細(xì)胞數(shù)增加直接相關(guān)。甲（formazan）結(jié)晶染料是水溶的，可以用分光光度計(jì)在500nm波長(zhǎng)檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的活性，可判斷細(xì)胞受損的程度此分析靈敏、方便、精確，適用于許多種細(xì)胞毒性分析。此分析大概需0.5－1h。

檢測(cè)方法：試劑：該檢測(cè)方法一般有配套的試劑盒，以400T的試劑盒為例，包括以下試劑：Components，400 assays，Catalyst(Lyophilized)，Dye Solution，1 vial，45 ml

工作液的制備：

a. 用ddH2O溶解催化劑（Catalyst）10min，充分混勻。催化劑溶液4℃可保存數(shù)周。

b. 染色液（Catalyst）4℃可保存數(shù)周。

c. 反應(yīng)混合液的制備：分析100 assays，混合250ul催化液和11.25ml染色液?；旌弦含F(xiàn)配現(xiàn)用。

細(xì)胞毒分析步驟

（1）收集細(xì)胞，用1×分析液（如，1％血清或1％BSA培養(yǎng)液）。

（2）在96孔板中分別制備下列樣本：

背景對(duì)照：每孔加200ul培養(yǎng)液，3個(gè)復(fù)孔。背景值應(yīng)從其他值中減去。

低對(duì)照：向每孔200ul分析液中加1－2×104細(xì)胞，3個(gè)復(fù)孔。

高對(duì)照：向每孔200ul含1％Triton X-100的分析液中加1－2×104細(xì)胞，3個(gè)復(fù)孔。

檢測(cè)樣本：向每孔200ul含檢測(cè)物質(zhì)的分析液中加1－2×104細(xì)胞，3個(gè)復(fù)孔。

（3）在培養(yǎng)箱中（5％CO2,90%濕度，37℃）孵育細(xì)胞，孵育時(shí)間為檢測(cè)物質(zhì)的適當(dāng)處理時(shí)間。

（4）離心細(xì)胞250g，10min。

（5）每孔小心轉(zhuǎn)移100ul上清到相應(yīng)的優(yōu)化清潔96孔板中。

（6）每孔加入100ul反應(yīng)混合液，室溫孵育30min。避光操作。

（7）用微孔讀板儀在490－500nm檢測(cè)所有樣本的吸光值。參考波長(zhǎng)大于600nm。

5. 計(jì)算細(xì)胞毒的百分比：

細(xì)胞毒（％）＝（檢測(cè)樣本－低對(duì)照）/（高對(duì)照－低對(duì)照）%

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